C型凝集素受体DC-SIGN在特应性皮炎发病中的作用机制研究

【摘要】特应性皮炎(atopicdermatitis,AD)是一种具有代表性的过敏性疾病,一种常见的慢性、复发性、炎症性皮肤病,主要表现为皮肤干燥、湿疹样皮疹和顽固瘙痒。在过去的三十年间,该病的发病率快速攀升,目前该病在儿童中发病率已占到15-30%,在成人中的发病率也达到了2-10%[21。AD的发病机制涉及到很多因素,包括遗传素质、环境因素、免疫功能异常和皮肤屏障功能障碍等。天然免疫系统和适应性免疫系统均参与AD发病,在病情急性发作及疾病持续发展中起重要的作用。AD患者因瘙痒反复搔抓加重皮肤屏障破坏,过敏原及病原微生物抗原更易透过皮肤产生过敏反应。树突状细胞(dendriticcells,DCs)广泛分布于皮肤和粘膜中,是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigenpresentingcells,APC),它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原。未成熟DC具有较强的迁移能力,成熟DC能有效激活初始T细胞,处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。DCs识别和递呈抗原是诱导获得性免疫反应发生的首要阶段。近几年来,人们认识到天然免疫系统的活化首先是通过抗原递呈细胞表面的模式识别受体(pattern-recognitionreceptor,PRRs)来介导的。DCs表面表达多种PRRs,包括C凝集素受体(C-typelectinreceptors,CLRs),Toll样受体(Toll-likereceptors)和核苷酸结合寡聚化蛋白受体(nucleotide-bindingoligomerizationdomainproteins,NODs)等。其中,CLRs通过识别病原体或过敏原表面的“糖指纹”,来传递外源信号,活化免疫细胞。在众多的CLRs中,DC-SIGN(DC-specificICAM-grabbingnon-integrin,DC-SIGN)日益受到人们的关注,主要表达于髓样DC和巨噬细胞表面,作为DCs的模式识别和黏附受体,DC-SIGN可在DCs黏附迁移及炎症反应、激活天然T细胞及启动免疫应答,以及病原体与肿瘤的免疫逃逸等诸多方面发挥重要作用,并可能是DCs执行和调控天然免疫与获得性免疫反应的一个重要的分子介导基础。DC-SIGN的胞外区糖识别域(CRDs)可识别结合特定的糖类抗原,如ManLAM和LewisX等。在生理条件下,DC-SIGN可通过促进DC捕获病原体胞壁成分糖蛋白,调节DC抗原处理和递呈功能。DC-SIGN与TLR家族在调节DC激活T细胞应答中也存在串话,这种串话通过细胞内信号分子改变而调节T细胞应答产生免疫活化或免疫抑制,诱导免疫应答趋于平衡,维持内环境稳定。研究发现,不同的病原体或抗原与DC-SIGN结合,诱导分泌的细胞因子不同,如胃幽门螺杆菌与DC-SIGN结合诱导Th2型细胞因子分泌增加；脑膜炎奈瑟氏菌变异体通过与DC-SIGN结合促进T细胞向Thl反应；乳酸杆菌与DC-SIGN结合可诱导调节性T细胞的分化。在诱导耐受方面也发现,妊娠期女性胎盘中DC-SIGN受体阳性的树突状细胞介导了母体免疫系统对胎儿抗原的免疫耐受；Huang等用严重食物过敏的小鼠动物模型研究发现,Man51-BSA选择性的作用于小鼠的肠道内的表达SIGNR1(DC-SIGN的同源性受体)的固有层树突状(laminapropriadendriticcell,LPDC)细胞,参与诱导致敏食物口服耐受。以上的发现均支持DC-SIGN在免疫调节方面的重要角色,是一种免疫调节受体。很多AD患者易感的病原微生物和过敏原都富含多糖结构,但是目前尚不清楚它们具体是如何通过DC-SIGN而活化DC,从而诱导特定型别T细胞免疫反应的。因此,从以下几方面研究DC-SIGN在AD患者的免疫功能异常中发挥的功能作用具有重要意义：①确定AD病人皮损处DC-SIGN表达情况；②富含多糖结构的病原菌或过敏原与可溶性DC-SIGN受体和细胞膜表达的DC-SIGN受体结合情况；③尘螨被DC-SIGN识别、内吞,及介导DCs活化后产生哪些细胞因子,从而诱导哪些型别的T细胞分化?本研究针对以上方面进行了系统研究,期望发现DC-SIGN受体在AD的发病中的作用。首先,采集AD患者皮损,并以银屑病皮损和正常人皮肤作为对照,免疫组化实验方法检测AD患者和对照组皮肤内DC-SIGN表达差异情况。其次,验证表达于DCs细胞上的DC-SIGN是否参与了变应原及病原菌的识别、内吞及递呈?通过ELISA.流式细胞技术及激光共聚焦显微镜技术检测数种过敏原与可溶性DC-SIGN蛋白及细胞表达的DC-SIGN受体的结合能力。再次,当过敏原经DC-SIGN通路诱导DCs活化成熟后,通过检测DC细胞培养上清及DC细胞表面标志,检查DC细胞活化、成熟状态。最后,将经过敏原刺激的成熟DC细胞与初始T细胞共培养,检测过敏原通过DC-SIGN介导DCs活化后对指导T细胞极化作用的影响。通过本实验发现,①DC-SIGN在AD患者皮肤内表达量增高,推测DC-SIGN可能在特应性皮炎的发病中起到一定的作用。②通过ELISA方法初步验证过敏原／病原菌与可溶性DC-SIGN受体的结合能力及最佳结合浓度。③以构建表达DC-SIGN受体的HEK293T细胞和体外诱导树突状细胞为模型模拟体内情况,运用流式细胞技术和激光共聚焦显微技术等方法验证了DC-SIGN受体介导了过敏原的结合及内吞。④尘螨刺激单核细胞诱导的树突状细胞(Monocytederiveddendriticcells,MDDCs)24h后,检测比较DC-SIGN受体和／或Toll样受体阻断组的细胞培养上清前炎症细胞因子及细胞表面标志,发现DC-SIGN受体阻断较其他组CD83表达受到抑制,培养上清中肿瘤坏死因子TNF-α和IL-6表达量降低,故得出DCs可通过DC-SIGN受体介导致活化和成熟。⑤最后将户尘螨过敏原刺激的成熟DCs与初始T细胞共培养,检测发现培养上清液中的IL-4和IL-22表达升高,间接证实了户尘螨通过DC-SIGN刺激DCs细胞活化后,进一步诱导了初始T细胞向Th2和Th22型免疫反应极化。本研究课题对进一步阐明过敏性皮肤病的发病机制和干预环节提供了重要的理论依据,也为开辟过敏性疾病发病机制研究的新领域和发展新的治疗策略提供理论和实验基础。
【作者】张宇；
【导师】王宝玺；
【作者基本信息】北京协和医学院，皮肤病与性病学，2014，博士
【关键词】特应性皮炎；DC-SIGN受体；C型凝集素受体；过敏原；病原菌；树突状细胞；天然免疫；T细胞；

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